Reagentes para Extração e Purificação de RNA
Código: 13-BR850-50

 

Apresentação: 50 extrações

Instruções de Uso

 

1. Uso pretendido
Os reagentes para extração e purificação de RNA, empregam colunas de sílica
(cartuchos/filtro). O seu uso é recomendado para sangue total, plasma, soro, urina, cultura de células, amostras coletadas em swab nasofaríngeo.

 

2. Características do Produto

Os reagentes para extração e purificação de RNA compõem um sistema genérico que
utiliza a tecnologia de colunas de sílica com elevada capacidade de ligação para isolamento
e purificação de RNA de amostras de plasma, soro, sangue total, urina, cultivo celular,
amostras coletadas em swab nasofaríngeo para procedimentos de diagnóstico in vitro. O
Carreador quando adicionado ao tampão de lise tem o objetivo de otimizar a extração de
RNA. A Proteinase K é utilizada para facilitar a lise de proteínas presentes nas amostras.

2.1. Composição do produto
Componentes (50 extrações) Volume Quantidade
Hemalise-RBC 10X 9,0 mL 01
Carreador de RNA liofilizado – 01
Proteinase K (PK) liofilizada – 01
Diluente PA/PK 1,0 mL 01
Tampão de Lise 20,0 mL 01
Tampão de lavagem A concentrado 16,5 mL 01
Tampão de lavagem B concentrado 9,0 mL 01
Tampão de Eluição 2,5 mL 01
Coluna de Sílica – 50 unid.
Tubo coletor – 50 unid.

 

2.2 Especificações
Os reagentes oferecem uma extração em coluna de sílica com excelente rendimento. Usorecomendado com matrizes biológicas respiratórias, sangue e meios de transporte.
O RNA extraído poderá ser utilizado em técnicas de biologia molecular, incluindo reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR, RT-qPCR).

2.3 Equipamentos, reagentes e insumos necessários, mas, não fornecidos
 Centrífuga – 20.000 x g (14.000 rpm),
 Micropipetas e ponteiras de 1-10uL – 100-1000L
 Agitador tipo Vórtex,

 Bloco de aquecimento, Banho Maria, Banho seco ou estufa, para incubação em 56°C.
 Etanol absoluto (95-100%),
 Microtubos de 1,5mL e 2mL,
 Tubos graduados, tipo Falcon (15mL e 50mL).
 Luvas descartáveis,

2.4 Preparo dos reagentes
A Proteinase K deverá ser diluída, adicionando 500 L (reagente para 50 extrações) do
Diluente PA/PK. Após reconstituído se recomenda armazenar em –20°C. Para cada
amostra a ser extraída, adicionar o volume de 10 uL da Proteinase K já reconstituído.
O Carreador de RNA deverá ser reconstituído adicionando 250 uL (reagente para 50
extrações) do Diluente PA/PK. Para cada amostra a ser extraída, adicionar o volume de 5uL de Carreador de RNA já reconstituído.
RECOMENDAÇÃO: Preparar alíquotas de carreador de RNA com volumes menores, para evitar repetidos ciclos de congelamento e descongelamento.
Preparo de Hemalise na concentração 1X:
Para cada amostra serão necessários 1,8 mL de solução de Hemalise 1X.
Diluir 1:10 a solução de Hemalise-RBC 10X em água ultrapura, sendo 1 parte de
Hemalise-RBC 10X e 9 partes de água ultrapura.
Tampão de Lavagem A e Tampão de Lavagem B são fornecidos concentrados. Antes do
primeiro uso adicionar a quantidade de etanol absoluto (95-100%) conforme indicado na
tabela e nos frascos:
Tampão de Lavagem A
Concentrado
Etanol absoluto 95-100%
adicionar
Volume final
16,5 mL 13,5 mL 30 mL
Tampão de Lavagem B
concentrado
Etanol absoluto 95-100%
adicionar
Volume final
9,0 mL 21,0 mL 30 mL

3. Armazenamento e transporte
Os componentes podem ser transportados em temperatura ambiente (10 a 30°C) e são
estáveis até a data de validade descrita na embalagem. O Tampão de Lise e o Tampão de Lavagem A podem exibir precipitados devido às baixas temperaturas. Se isso ocorrer,
aquecer o frasco com precipitados, entre 55°C e 65°C homogeneizando ocasionalmente até a dissolução completa.

Validade
Os reagentes para Extração e Purificação de RNA tem validade de 12 meses quando
mantidos fechados e armazenados corretamente.

5. Informação de Segurança

5.1 Os reagentes devem ser utilizados somente por pessoal técnico qualificado e
devidamente treinado.
5.2 Todo o pessoal envolvido na execução do ensaio deve utilizar equipamentos de
proteção individual. Além disso, todos devem ser treinados em procedimentos de
biossegurança, como recomendado pela legislação em vigor.
5.3 O ambiente do laboratório deve ser controlado, a fim de evitar contaminantes como
poeira ou agentes microbianos transportados pelo ar.
5.4 Após o recebimento dos reagentes, verificar se as embalagens dos componentes
estão danificadas ou se há vazamento dos líquidos. Proteger-se adequadamente e
caso seja necessário realizar a reclamação correspondente.
5.5 Não utilizar componentes danificados, pois eles podem gerar baixo rendimento.
5.6 Não trocar os componentes diferentes, se não forem do mesmo lote.
5.7 Não utilizar os reagentes após a data de validade apresentada na etiqueta externa.
5.8 Armazenar os químicos e plásticos em condições próprias para uso em laboratório.
5.9 Para minimizar risco de contaminações é recomendado trabalhar em cabine de fluxo
laminar.
5.10 Evitar contaminação cruzada das amostras utilizando ponteiras descartáveis e
trocando-as após cada pipetagem. Utilizar ponteiras com filtro.
5.11 Evitar contaminação cruzada entre os reagentes dos reagentes utilizando ponteiras
descartáveis e trocando-as após cada pipetagem. Utilizar ponteiras com filtro.
5.12 Caso sejam necessárias mais informações a respeito do produto, favor entrar em
contato com a NOVA BIOTECNOLOGIA.

6. Procedimento
Sangue total, soro, plasma, urina, cultura de células, amostra de coleta de swab
nasofaríngea. Podem ser processados com os reagentes de extração de RNA em coluna.
Para uma purificação satisfatória é importante obter material homogêneo, limpo e não
viscoso antes de carregar as colunas. Desta forma, é importante verificar a existência de
precipitados em todas as amostras (especialmente amostras antigas e congeladas).
6.1 Preparações das amostras
Os reagentes para extração de RNA foram desenvolvidos para purificação a partir de 200L
de amostras de sangue total, soro, plasma, cultura de células. Para amostras nasofaríngeas
a partir de 300L. Para amostras de urina centrifugar 2mL para uso do pellet (vide 7.1).

Amostra de Sangue total: pré-tratamento:
1. Em microtubo de 2 mL, adicionar 200 µL de sangue total com anticoagulante.
2. A seguir, adicionar 1,8 mL de solução de Hemalise 1X.
3. Inverter o microtubo por 10 vezes para homogeneizar a solução de Hemalise.
4. Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos.
5. Centrifugar o microtubo a 20.000 x g (14,000 rpm) durante 3 minutos.
6. Desprezar o máximo possível do sobrenadante pipetando no lado oposto do pellet.
7. Seguir para o protocolo geral, item 7.1.
Amostras de urina: pré-tratamento:
1. Em um microtubo de 2mL adicionar 2mL de urina.
2. Centrifugar a 20.000 x g (14.000 rpm) durante 5 minutos.
3. Desprezar o máximo possível do sobrenadante pipetando no lado oposto do pellet.
4. Seguir para o protocolo geral item 7.1.
7. Protocolo geral
7.1 Em um microtubo de 2mL com a amostra; adicionar 400 µL do Tampão de Lise.
7.2 Adicionar 10L de Proteinase K.
7.3 Vortexar o microtubo por 15 segundos.
7.4 Centrifugar rapidamente para remover as gotas de líquido da tampa do microtubo.
7.5 Incubar a 56°C (Banho Maria, Banho seco ou estufa) por 10 minutos.
7.6 Retirar e deixar em temperatura ambiente (10-30°C) por 2 minutos.
7.7 Adicionar 5 L do carreador de RNA e homogeneizar em vórtex por 15 segundos.
7.8 Centrifugar rapidamente para remover as gotas de líquido da tampa do microtubo.
7.9 Incubar em temperatura ambiente (10-30°C) por 10 minutos.
7.10 Adicionar ao mesmo microtubo 450L de Etanol Absoluto (não fornecido).
Homogeneizar imediatamente por inversão.
NOTA: a homogeneização deve ser imediata para evitar qualquer precipitação
irregular do RNA devido as altas concentrações do etanol.
7.11 Vortexar o microtubo por 15 segundos.
7.12 Centrifugar rapidamente para remover as gotas de líquido da tampa do microtubo.
7.13 Transferir 600 µL da amostra preparada para coluna de sílica já acoplada ao tubo
coletor.
NOTA: Não descartar o volume restante da amostra preparada (aproximadamente
500L)
7.14 Fechar a tampa da coluna de sílica e centrifugar a 6.000 x g (8.000 rpm) durante 1
minuto.
7.15 Descartar o líquido do tubo coletor e acoplar novamente a coluna de sílica.

scartar o líquido do tubo coletor e acoplar novamente a coluna de sílica.
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7.16 Repetir o item 7.13 a 7.15, para transferir o restante do preparado da amostra.
7.17 Adicionar 500 µL do Tampão de Lavagem A na coluna de sílica já acoplada ao
tubo coletor.
7.18 Fechar a tampa da coluna de sílica e centrifugar a 6.000 x g (8.000 rpm) durante 1
minuto.
7.19 Descartar o líquido do tubo coletor e acoplar novamente a coluna de sílica.
7.20 Adicionar 500 µL do Tampão de Lavagem B na coluna de sílica já acoplada ao
tubo coletor.
7.21 Fechar a tampa da coluna de sílica e centrifugar a 6.000 x g (8.000 rpm) durante 1
minuto.
7.22 Descartar o líquido do tubo coletor e acoplar novamente a coluna de sílica.
7.23 Centrifugar novamente a 20.000 x g (14.000 rpm) durante 3 minutos para remover
completamente a solução de lavagem.
7.24 Transferir a coluna de sílica para um microtubo de 1,5 mL (não fornecido).
7.25 Aplicar 50 µL do Tampão de Eluição diretamente a membrana de sílica.
7.26 Incubar a temperatura ambiente por 2 minutos.
7.27 Fechar a tampa da coluna de sílica e centrifugar a 6.000 x g (8.000 rpm) durante 1
minuto.
7.28 Manter o RNA eluido a -20°C para armazenamento e/ou transporte ou utilizá-lo
imediatamente.