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Reagente de Bradford

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Reagente de Bradford (pronto-para-uso) para determinação da concentração de proteínas – 500mL

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Reagente de Bradford (pronto-para-uso)
Para determinação da concentração de proteínas
Código: 13-1309-05 NCM : 29420000
Volume: 500 mL
(acompanha 4 mg de BSA)
Armazenamento: 2-8°C
Descrição do produto:
O Reagente de Bradford deve ser usado para determinar a concentração de proteínas em solução. O procedimento é baseado na formação de um complexo entre o corante, Brilliant Blue G, e proteínas em solução. O complexo formado entre a proteína e o corante provoca uma mudança na absorção máxima nas leituras entre 465 e 595nm. O valor de absorção é proporcional à concentração de proteína presente. O Reagente de Bradford não requer diluição e é ideal para microensaios, multiensaios e ensaios padrões. A linearidade do ensaio é de 0,1-1,4 mg/mL de proteína, usando BSA (albumina bovina sérica) como proteína padrão.
O Reagente de Bradford é compatível com agentes redutores, que são comuns para estabilização de proteínas em solução. Outros ensaios para quantificação de proteínas (Lowry e BCA) não são compatíveis com tais agentes. O Reagente de Bradford deve ser utilizado no lugar destes ensaios se agentes redutores estiverem presentes. Entretanto, o Reagente de Bradford só é compatível com concentrações baixas de detergentes (vide tabela de compatibilidade).  Se a amostra de proteína a ser utilizada possui detergente presente no tampão, sugere-se a determinação através do ensaio de BCA.
Reagente:
O produto consiste em Brilliant Blue G com ácido fosfórico e metanol. Frasco com 500 mL mL é suficiente para, pelo menos 5.000 determinações. Acompanha 4 mg de padrão de proteína liofilizada (BSA) para ser diluída para a concentração de 1mg/mL em água deionizada.
Reagentes e equipamentos requeridos (dependendo do formato do ensaio)
– Espectrofotômetro capaz de realizar leitura de absorbância na faixa de 465 e 595 nm.
– Tubos de ensaio, 13 x 100 mm
– Cuvetas de 2,0 mL (espectrofotômetro de cuvetas)Armazenamento e estabilidade:
O produto se armazenado entre 2 e 8ºC é estável por 1 ano. A BSA reconstituída é estável por 60 dias entre 2 a 8ºC ou 6 meses entre -20 a -70ºC. 

Procedimento:
1. Reconstituição do padrão de BSA
Para reconstituir o padrão de Albumina bovina sérica, adicionar 4 mL de água deionizada e agitar até dissolução completa.  Se o padrão não for utilizado em 60 dias aconselha-se congelar em -20°C.
2. Protocolo sugerido:
2.1 Preparar entre 3 a 5 diluições da proteina padrão (BSA). A linearidade para o ensaio com BSA é de 0,1 a 0,9 mg/mL.
2.2 Pipetar 100 mL de cada padrão e amostra nos tubos recomendados. Ensaios com proteína normalmente são testados em duplicata ou triplicata.
2.3 Adicionar 5,0 mL da solução de Bradford pronta-para-uso e leve os tubos para agitação no vôrtex.
2.4 Incubar em temperatura ambiente pelo menos 5 minutos. A absorbância em 595 nm poderá se ver aumentada com o decorrer do tempo, levando a resultados não desejados. Assim os ensaios deverão ser finalizados no máximo em uma hora.
2.5 Realizar as leituras no espectrofotômetro (595 nm) como de costume, zerando o aparelho com água deionizada.

Referências:
1. Bradford, M.M., Anal. Biochem., 72, 248 (1976).
2. Compton, S.J. et al., Anal. Biochem., 151, 369-374 (1985).
3. Friedenauer, D. et al., Anal. Biochem., 178, 263-268 (1989).
4. Rubein, R.W. et al., Anal. Biochem., 83, 773-777 (1977).
5. Sedmak, J.J., and Grossberg, S.E., Anal. Biochem., 79, 544 (1977).
6. Sokuttgerber, A.G. et al., Anal. Biochem., 179, 198-201 (1989).
7. Tal, M. et al., J. Biol. Chem., 260, 9976-9980 (1985).

Tabela de compatibilidade (vide o verso)
Os valores listados no anexo são as concentrações máximas que podem estar presentes na amostra sem causar interferência no padrão e/ou nas amostras.

Substâncias incompatíveis [ ] Compatível
Tampões
ACES, pH 7.8 100 mM
N-Acetylglucosamine in PBS, pH 7.2 100 mM
Bicine, pH 8.4 100 mM
Bis-Tris, pH 6.5 100 mM
Calcium chloride in TBS, pH 7.2 10 mM
CHES, pH 9.0 100 mM
Cobalt chloride in TBS, pH 7.2 10 mM
EPPS, pH 8.0 100 mM
Ferric chloride in TBS, pH 7.2 10 mM
Glycine 100 mM
HEPES, pH 7.5 100 mM
Imidazole, pH 7.0 200 mM
MES (0.1 M), NaCl (0.9%), pH 4.7 não diluído
MES, pH 6.1 100 mM
MOPS, pH 7.2 100 mM
Nickel chloride in TBS, pH 7.2 10 mM
PBS; Phosphate (0.1 M), NaCl (0.15 M), pH 7.2 não diluido
PIPES, pH 6.8 100 mM
Sodium acetate, pH 4.8 180 mM
Sodium bicarbonate 0.1 M
Sodium citrate, pH 4.8 or pH 6.4 200 mM
Sodium Citrate (0.6 M), MOPS (0.1 M), pH 7.5 não diluido
Sodium phosphate 0.1 M
TBS; Tris (25 mM), NaCl (0.15 M), pH 7.6 não diluido
Tricine, pH 8.0 100 mM
Triethanolamine, pH 7.8 100 mM
Tris 2.0 M
Tris (25 mM), Glycine (192 mM), pH 8.0 não diluido
Tris (25 mM), Glycine (192 mM), SDS (0.1%), pH 8.3 diluido 1:2
Zinc chloride in TBS, pH 7.2 10 mM
Aditivos
Ammonium sulfate 1.0 M
Aprotinin 10 mg/L
Asparagine 10 mM
Cesium bicarbonate 0.1 M
Glucose 1.0 M
Glycerol 10%
Guanidine•HCl 3.5 M
Hydrochloric Acid 0.1 M
Imidazole, pH 7.0 200 mM
Leupeptin 10 mg/L
Phenol Red 0.5 mg/ml
PMSF 1 mM
Sodium azide 0.5%
Sodium chloride 5.0 M
Sodium Hydroxide 0.1 M
Sodium orthovanadate in PBS, 1 mM 1 mM
Thimerosal 0.01%
Sucrose 10%
TLCK 0.1 mg/L
TPCK 0.1 mg/L
Urea 3.0 M 3.0 M
Detergentes
BRIJ-35 0.125%
BRIJ-52 0.031%
CHAPS 5%
CHAPSO 5%
Deoxycholic acid 0.050%
Nonidet P-40 (IGEPAL® CA-630) 0.5%
SB3-14 0.125%
Octyl b-glucoside 0.5%
Octyl b-thioglucopyranoside 3%
SDS 0.125%
SPAN 20 0.5%
TRITON X-100 <0.1%
TRITON X-114 0.125%
TRITON X-305 0.5%
TRITON X-405 0.5%
TWEEN 20 0.062%
TWEEN 60 0.1%
TWEEN 80 0.062%
Agentes quelantes
EDTA 100 mM 100 mM
EGTA 2 mM 2 mM
Sodium citrate, pH 4.8 or pH 6.4 200 mM
Agentes redutores e tióis
2-Mercaptoethanol 1.0 M
Ascorbic acid 50 mM
Cysteine 10 mM
Dithioerythritol (DTE) 1 mM
Dithiothreitol (DTT) 5 mM
Potassium thiocyanate 3.0 M
Solventes
Acetone 10%
Acetonitrile 10%
DMF 10%
DMSO 10%
Ethanol 10%
Methanol 10%
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