SYBR Green qPCR Master Mix LOW ROX – 100 Reações
Código: 13-10505-01

 

Instruções de Uso

1. Descrição
   O SYBR Green qPCR Master Mix (2X concentrada) contendo a enzima HotStart Taq DNA Polimerase e
   o corante de referência passiva Low Rox são indicados para uso em PCR em tempo real quantitativo
   (qPCR).
   Este kit foi otimizado para aplicações de PCR em Tempo Real que demandam alta sensibilidade e
   especificidade na detecção de alvos de DNA utilizando o corante fluorescente SYBR Green incluindo a
   detecção e quantificação de agentes infecciosos, genes de organismos geneticamente modificados e
   análise da expressão gênica.
   A tecnologia Hot Start é realizada através de um anticorpo que bloqueia a atividade da enzima Taq
   DNA Polimerase a temperatura ambiente e apresenta vantagens para detecção e quantificação de DNA
   em reações de qPCR em tempo real devido à eliminação da amplificação de produtos de PCR
   inespecíficos e formação de dímeros de primers (primers dimers).
   O SYBR Green qPCR Master Mix é um reagente de nova geração que pode reduzir o tempo da qPCR
   para 30-40 minutos. Observação: Os tempos de reação podem variar a depender das sequências dos
   produtos de PCR ou de acordo com a otimização dos primers

2. Componentes do Kit
   Contém reagentes para a realização de reações de PCR em Tempo real com volume final de 20µL
   incluindo:

 

Cat. No.	13-10505-01	100 reações
1 x 1,00 mL	SYBR Green qPCR Master Mix LOW ROX	microtubo âmbar de 1,5 mL

3. Modo de Uso

Programar o equipamento de PCR em tempo real para a realização da Reação de SYBR Green qPCR
com os seguintes parâmetros de temperatura e tempo de reação:

Protocolo de qPCR em 2 etapas

	Temp	Tempo	Ciclos
Ativação Taq DNA Polimerase	95oC	2 minutos	–
Desnaturação	95oC	15 segundos	30 ciclos
Pareamento e Extensão	60oC	1 minuto
Curva de Dissociação	–	–	–

Programar a leitura da fluorescência do corante SYBR Green na etapa de Pareamento e Extensão (60oC
por até 1 minuto) da reação de qPCR.
A Curva de Dissociação também é chamada de Curva de “Melting” ou “Melting Curve” e deverá ser
realizada de acordo com o manual de instruções do equipamento de PCR em tempo real.

Protocolo de qPCR em 3 etapas

Para alguns alvos de DNA, a realização da reação de qPCR em 3 etapas pode apresentar melhores resultados:

	Temp	Tempo	Ciclos
Ativação Taq	95oC	2 minutos	–
Desnaturação	95oC	15 segundos	30 ciclos
Pareamento	55oC	15 segundos
Extensão	68oC ou 72oC	45 segundos
Curva de Dissociação	–	–	–

A temperatura ótima da reação de qPCR (pareamento dos primers) pode variar entre 50oC a 60oC.
Programar a leitura da fluorescência do corante SYBR Green na etapa de Extensão (68oC ou 72oC por
até 1 minuto) da reação de qPCR.
A Curva de Dissociação também é chamada de Curva de “Melting” ou “Melting Curve” e deverá ser
realizada de acordo com o manual de instruções do equipamento de PCR em tempo real.
Preparar a mistura da reação de qPCR:

Componentes	Volume	Concentração Final
SYBR Green qPCR Master Mix LOW ROX (2X conc.)	10,0 µL	1X
Primer Forward (10 µM)	0,5 µL	0,2 µM *
Primer Reverse (10 µM)	0,5 µL	0,2 µM *
DNA Template	< 11,5 µL	–
Nuclease-free water
Volume Total	20 µL	–

*A concentração ótima dos primers em reações PCR em Tempo Real pode variar entre 0,1 µM e 0,5 µM.

Para múltiplas reações, preparar uma mistura principal contendo 2X SYBR Green qPCR Master Mix,
Primer Forward, Primer Reverse e H2O para Biologia Molecular, adicionar o volume correspondente
nos microtubos ou poços da microplaca de amplificação e a seguir, adicionar o DNA purificado por um
kit ou reagente de biologia molecular. Fechar os microtubos ou microplaca de amplificação. Colocar os
microtubos ou microplaca no termociclador e iniciar a reação de qPCR.
Notas sobre a otimização da Reação de SYBR Green qPCR:
– Concentração dos Primers
Altas concentrações de primers na reação de SYBR Green qPCR favorecem a formação de produtos de
PCR inespecíficos e dímeros de primers (“primers dimers”).
Por outro lado, baixas concentrações de primers diminuem a sensibilidade da reação de qPCR.
Assim sendo, caso necessário, otimizar a reação de SYBR Green qPCR utilizando as seguintes
concentrações de primers: 0,1 µM, 0,2 µM, 0,3 µM, 0,4 µM e 0,5 µM.

4. Controle de Qualidade

Cada lote do kit SYBR Green qPCR Master Mix LOW ROX é avaliado em reações de PCR em Tempo Real
seguindo o protocolo descrito neste manual (Protocolo de qPCR em 2 etapas) para a amplificação do
gene gliceraldeído-3-fosfato desidrogenasse humano (GAPDH) a partir de 10ng de DNA genômico
humano.
A análise do ensaio de qPCR em tempo real deverá demonstrar a detecção do gene GAPDH com Ct
(cycle threshold) < 30 e a ausência de produtos de PCR inespecíficos e dímeros de primers na Curva de
“Melting” da reação de qPCR.
Produto para uso em pesquisas científicas. RUO.

5. Armazenamento

Armazenamento e transporte a -20°C. Validade: 24 meses se mantido nas condições de
armazenamento ideais.

6. Informação de Segurança

• • Sempre que estiver trabalhando com soluções químicas e amostras biológicas, EPIs são necessários
  conforme normas de segurança regulamentadas.
  • Depois de receber o produto verificar se as embalagens estão danificadas ou se há vazamento.
  • Produto de uso apenas laboratorial e deverá ser armazenado em condições próprias para uso em
  laboratório.
  • Caso sejam necessárias mais informações a respeito do produto, favor entrar em contato com a
  NOVA BIOTECNOLOGIA.

7. Garantia da Qualidade

A NOVA BIOTECNOLOGIA fornece garantia do produto SYBR Green qPCR Master Mix LOW ROX por
ela fornecida contra defeitos de produção pelo período de validade do produto, salvo especificações
em contrário a constar da proposta.
• A garantia abrange defeitos de produção.
• Exceções na garantia:
• Todos os produtos com defeitos oriundos de mau uso, imperícia, conservação ou armazenagem
inadequada.
• Quando não for utilizado de acordo com sua finalidade de aplicação.

 

Observação

*Reservamos o direito de corrigir erros gráficos e de digitação.

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