PROBE qPCR Master Mix – Alta Sensibilidade e Precisão para PCR em Tempo Real – 13-10506-01

PROBE qPCR Master Mix (100 reações x 25µL)

Código: 13-10506-01
Armazenamento: –20°C
Estabilidade: Este kit é estável durante 10 dias à temperatura ambiente.

Descrição

O PROBE qPCR Master Mix é um kit desenvolvido para ensaios de PCR quantitativos (qPCR) utilizando sondas fluorogênicas, incluindo as sondas TaqMan. Ele contém a enzima Hot Start Taq DNA Polimerase, uma polimerase recombinante complexada com um anticorpo monoclonal anti-Taq. Esse mecanismo bloqueia a atividade da enzima à temperatura ambiente, proporcionando um “início a quente” automático para aumentar a sensibilidade e especificidade da detecção.

Este kit foi otimizado para PCR em tempo real que exige alta sensibilidade e especificidade, sendo indicado para:

• Detecção e quantificação de agentes patogênicos;
• Identificação de organismos geneticamente modificados;
• Análise de expressão gênica.

O PROBE qPCR Master Mix é compatível com diversos instrumentos de PCR em tempo real, incluindo modelos que não requerem ROX:

• Roche: LightCycler 480
• Qiagen: Rotor-Gene Q / 3000 / 6000
• Eppendorf: Mastercycler ep / realplex
• Illumina: Eco qPCR
• Bio-Rad: CFX96 / CFX384, iCycler iQ / My iQ / IQ5
• Thermo Scientific: PikoReal Real-Time PCR
• Applied Biosystems: 7500 / 7500 Rápido / VIIa 7 / QuantStudio 12K Flex
• Stratagene: Mx3000P / Mx3005P / MX4000
• Bioer

Componentes do Kit

Cada kit contém reagentes suficientes para 100 reações com volume final de 25µL:

Código	Descrição	Volume	Quantidade
13-10506-01	2X PROBE qPCR Master Mix	1.25 mL	1 tubo
–	Hot Start Taq DNA Polymerase	50 µL	1 tubo
–	Amostra q.s.p 10 reações	–	–

Protocolo

Este protocolo é para um volume final de reação de 25µL. O volume pode ser ajustado conforme necessário.

Preparo Inicial

1. Descongelar os componentes à temperatura ambiente.
2. Ressuspender o 2X PROBE qPCR Master Mix, primers e sonda usando vôrtex. Centrifugar brevemente para garantir a homogeneização.
3. Manter todos os componentes e amostras em gelo para maximizar a especificidade.

Preparo da Mistura de Reação

Componente	Volume	Conc. Final
2X PROBE qPCR Master Mix	12.5 µL	1X
Primer Forward (20 µM)	0.5 µL	0.4 µM (0.2 – 0.8 µM)
Primer Reverse (20 µM)	0.5 µL	0.4 µM (0.2 – 0.8 µM)
Probe (10 µM)	0.5 µL	0.2 µM
Hot Start Taq DNA Polymerase	0.5 µL	–
DNA Template	<10.5 µL	–
Nuclease-free water	Ajustar para 25 µL	–

Condições de Amplificação Sugeridas

Protocolo Step Cycling

Estágio	Passo	Temperatura	Tempo
Hold	Desnaturação Inicial	95°C	2 min
40 ciclos	Desnaturação	95°C	15 seg
	Anelamento e Extensão (Aquisição de Dados)	60°C	60 seg*

Observação: O tempo de extensão depende da aquisição de dados, devendo ser ajustado conforme o equipamento de qPCR utilizado.

Protocolo Alternativo Step Cycling

Estágio	Passo	Temperatura	Tempo
Hold	Desnaturação Inicial	95°C	2 min
40 ciclos	Desnaturação	95°C	15 seg
	Anelamento	50–60°C	15 seg
	Extensão (Aquisição de Dados)	72°C	45 seg

Ensaio de Otimização

O desenho de primers e sondas altamente específicos é crucial para uma qPCR bem-sucedida. O uso de programas para desenho de primers é recomendado para evitar a formação de estruturas secundárias e auto-anelamento.

Recomendações:

• O tamanho do amplicon deve ser entre 65–200 pb.
• A concentração de primers deve ser 200–800 nM, com uma concentração ideal de 400 nM por primer e 200 nM para a sonda.
• Dependendo do par de primers, pode ser necessário um protocolo de ciclagem de 3 etapas.